Скачать методичку

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и иммунохимической реакции «антиген/антитело (исследуемый белок)». Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков и специфичности моно- или поликлональных антител. В оптимально подобранных условиях Вестерн-блоттингом можно обнаружить белок в количестве менее 1 нг.

Этапы Вестерн-блоттинга:

1. Разделение белков методом SDS-электрофореза. Наиболее распространенным способом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле, в присутствии додецилсульфата натрия (англ. SDS). В присутствии SDS белки подлежащие анализу приобретают одинаковый отрицательный заряд, что делает возможным их разделение в зависимости только от молекулярной массы. Денатурированные белки мигрируют в электрическом поле через акриламидный гель к аноду, при этом белки меньшего размера двигаются быстрее. Так же на гель наносят маркеры (смесь белков с известными молекулярными массами). Отличия в скорости продвижения (электрофоретической подвижности) приводит к разделению белков на полосы.
2. Перенос белков из геля на мембрану (изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (англ. PVDF) происходит под действием электрического тока. В результате этого процесса белки оказываются в тонком поверхностном слое мембраны, где за счет гидрофобных и электростатических взаимодействий происходит их связывание с мембраной. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.
3. Блокирование. Для того, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител с мембраной, последнюю инкубируют в разбавленном растворе белка — обычно используют бычий сывороточный альбумин или обезжиренное сухое молоко. Белок из разбавленного раствора связывается с мембраной в тех местах, где нет белковых полос. В результате антитела при их добавлении могут связываться только со специфичными сайтами связывания исследуемых белков. Блокирование позволяет достичь чистого фона и исключить получение ложноположительных результатов.
4. Связывание исследуемого белка с антителами. После блокирования мембраны ее отмывают буфером (3 раза) и последовательно инкубируют с различными антителами методом «сэндвича»: сначала белки связываются с первичными (моно- или поликлональными) антителами, которые, в свою очередь, связываются со вторичными антителами, конъюгированными с ферментами (пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой).
5. Детекция. Визуализации исследуемого белка достигают путем проведения соответствующей биохимической реакции с образованием продукта, который определяют колориметрическим, хемилюминесцентным или флюоресцентным методами детекции. Количество белка оценивают с помощью денситометрии.

Планируется визуализировать и определить количество белка светособирающего комплекса фотосистемы 2 – Lhcb2 из тилакоидов Arabidopsis thaliana.
Все вопросы и предложения присылать по адресу: fedor4uk.t@gmail.com, Татьяна.