Скачать методичку

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени или количественная ПЦР (кПЦР) используется для определения содержания в образце транскриптов исследуемого гена (то есть, содержания матричной РНК), как один из подходов к исследованию физиологической роли определенных ферментов по изменению интенсивности экспрессии генов, их кодирующих, в ответ на действие факторов среды. В медицине количественное определение ДНК инфекционных агентов в ходе лечения позволяет получать информацию о правильности или безрезультатности проводимой терапии и помогает предсказывать периоды обострения заболевания.

Суть метода ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. Для идентификации в образце искомой ДНК применяются праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, подобранные таким образом, что они комплементарны концевым участкам ДНК-мишени и, таким образом, ограничивают нужный фрагмент ДНК. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты служат матрицей для копирования ферментом ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение числа фрагментов ДНК.
Для осуществления кПЦР из объекта исследования, в первую очередь, выделяют РНК, которую затем с помощью фермента обратная транскриптаза переводят в форму ДНК (реакция т.н. обратной транскрипции). Полученные таким образом молекулы кДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР.

В рамках школы Фотобиологии предлагается демонстрация (с участием студентов) методики выделения РНК из растений Arabidopsis thaliana с последующим проведением обратной транскрипции и измерению с использованием метода кПЦР уровня экспрессии двух различных генов, кодирующих карбоангидразы (ферменты, осуществляющие катализ обратимой реакции гидратации углекислого газа) растительной клетки.

Контакты: Руденко Наталья Николевна rudenko_n@rambler.ru
ИФПБ РАН, Московская область, 142290 г. Пущино, ул. Институтская 2
+7(4967)732448.